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Linha de Luz Manacá

MANACÁ – Micro Macromolecular e Nano Cristalografia – é uma linha de luz de quarta geração do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS-Sirius) dedicada à determinação de estruturas de macromoléculas biológicas utilizando cristalografia de raios X. A equipe de linha está expandindo suas capacidades para métodos de última geração de cristalografia proteica, como temperatura ambiente (RT) e cristalografia serial (SSX).  Desenvolvemos e implementamos uma abordagem de pipeline de alvo fixo com um suporte de amostra impresso em 3D, otimizado para cristalização de amostras, manuseio e coleta de dados de multi-cristais. O suporte para análise de dados em cristalografia convencional e serial está disponível para os usuários.

A linha de luz MANACA está aberta para submissão de propostas em fluxo contínuo, para utilização até 15 de dezembro de 2022. A estação experimental possui um trocador automático de amostras que pode montar uma amostra em menos de 1 minuto, permitindo a coleta de dados de mais de 30 amostras por turno.  Estão sendo preparadas configurações para coleta e análises de dados de cristalografia serial, bem como procedimentos de automação e coleta remota. Propostas devem ser submetidas pelo portal SAU ONLINE e datas de utilização podem ser agendadas pelo email manaca@lnls.br.

CONTATO & EQUIPE

Tel. da Instalação: +55 19 3517 5170
E-mail da Instalação: manaca@lnls.br

Coordenação: Ana C. de M. Zeri
Tel.: +55 19 3517 2498
E-mail: ana.zeri@lnls.br

Clique aqui  para mais informações sobre a equipe responsável por esta Instalação.

LAYOUT E ELEMENTOS ÓPTICOS

A linha de raios X MANACÁ emprega dois espelhos de raio X como óptica focal. Na cabana óptica, o primeiro elemento óptico da linha de feixe é um Monocromador horizontal de Cristal Duplo (DCM) equipado com dois pares de cristais Si (111 e 311), seguido pelo espelho de foco vertical (espelho cilíndrico sagital de salto lateral). O espelho de foco horizontal (espelho elíptico tangencial) está na cabana experimental microMANACA. Este sistema fornece atualmente uma seção transversal de feixe variando de 20×20 a 80×100 μm² (FWHM). Esta configuração óptica permite variar o tamanho do feixe na posição da amostra, alterando ligeiramente o ângulo de incidência dos espelhos, uma grande característica para combinar feixe e tamanho de cristal, e é otimizado para alto fluxo.

Os tamanhos de feixes tístos no ponto focal são alcançados por pequenos deslocamentos angulares nos espelhos M1 e M2, e uma pequena movimentação lateral da mesa de trabalho experimental. A estação experimental microMANACÁ abriga o espelho M2, atenuadores, estágio amostral, detector e sistema de entrega de amostras. A mesa de granito do estágio de amostra contém as fendas, obturadores, goniômetro baseado em ar, feixe, obturador, dispositivos de monitoramento de feixes e microscópio de vídeo no eixo (Arinax, Inc). Um suporte metálico mantém o sistema crio-cooler, detector de fluorescência e outros elementos a serem definidos no futuro, como um umidificador para experimentos de temperatura ambiente. Uma mesa separada contém o sistema automatizado de entrega de amostras.

PARÂMETROS

Parâmetro Valor Condição
Faixa de energia 5 – 20 keV
Resolução de energia (ΔE/E) 10-4
Conteúdo de harmônicos <10-4
Varredura de energia Sim
Tamanho do feixe 0,5×0,5 μm
10×7 a 100×80 μm
Estação nano
Estação micro
Divergência do feixe < 0.5 mrad

ESTAÇÕES E TÉCNICAS EXPERIMENTAIS

As configurações de feixe para o modo criogênico convencional (oscilação) estão disponíveis na linha MANACÁ para coleta de dados no local e/ou remotamente, usando um trocador automático de amostras com controle de experimentos feito pelo MXCuBE3 e pipeline automático de processamento de dados (da redução de dados à coleta inicial de dados).

A linha MANACÁ agora oferece um trocador de amostras automatizado, capaz de segurar 48 pinos em um dewar preenchido com nitrogênio líquido. As amostras devem ser congeladas nos pinos SPINE “MiTeGen B5” e “MiTeGen B5-R” e “Hampton SPINE HT”.

O braço robótico transfere a amostra para o goniômetro fixo e o fluxo de nitrogênio é retomado. O usuário pode acessar uma visão ao vivo de uma câmera focada na amostra, bem como as imagens do microscópio de amostra BZOOM, através da interface MXCube. O braço robótico é enviado para colher um pino de amostra da dewar depois de verificar se não há outra amostra na base do goniômetro; o braço pega uma amostra e a entrega ao suporte da amostra. Em seguida, vemos a visão da amostra através do microscópio no eixo, através da interface MXCube.

Fazemos parte da comunidade de desenvolvimento de software MXCUBE, e atualmente empregamos MXCube3, versão web, que pode ser acessada remotamente e permite o uso das interfaces de linha.

Paralelamente à coleta de dados, os usuários podem acessar uma série de pipelines de software para tratar os dados e analisar a qualidade do experimento assim que ele estiver concluído. Atualmente, um conjunto de dados pode ser adquirido em cerca de 6 minutos.

Várias estratégias estão sendo implementadas para coletar dados multi-cristal/serial (SSX) e em temperatura ambiente (RT) e resolvidos no tempo, desde dispositivos de coleta de amostras até software para tratamento de dados

REQUISITOS DE AMOSTRAS

A linha MANACÁ agora oferece um trocador de amostras automatizado, capaz de segurar 48 pinos em uma dewar preenchida com nitrogênio líquido. As amostras devem ser congeladas em pinos SPINE 18mm em Unipucks.

Várias estratégias estão sendo implementadas para coletar dados multi-cristal/serial (SSX) de temperatura ambiente (RT) e tempo resolvidos, desde dispositivos de coleta de amostras até software para tratamento de dados.

Cristais proteicos podem ser preparados na instalação ROBOLAB do LNBio, acessível através do portal SAU ONLINE.

APLICAÇÕES

RESOLUÇÂO DE ESTRUTURAS DE PROTEÌNAS

A possibilidade de determinar a estrutura tridimensional das proteínas, ou seja, as posições de cada um dos átomos e suas interações, permitiu o desenvolvimento de novas tecnologias para a descoberta de medicamentos e se tornou um dos exemplos mais marcantes de avanços trazidos pelos síncrotrons. De fato, hoje existem mais de 150000 estruturas proteicas conhecidas registradas no Protein Data Bank (PDB.org), cerca de 80% das quais foram resolvidas com o uso de radiação síncrotron. O Banco de Dados de Proteínas já possui várias estruturas coletadas no LNLS, e algumas já coletadas na linha MANACA empregando estratégias de descoberta de drogas baseadas em fragmentos (FBDD).

A estratégia racional de design de drogas, por exemplo, tenta identificar oportunidades de bloquear ou modificar essas interações moleculares de proteínas. Ao identificar uma proteína como alvo de uma determinada terapia, os estudos estruturais com radiação síncrotron podem mostrar como as drogas se ligam a uma proteína, identificam modificações estruturais para melhorar a ligação da droga, ou mesmo sugerem quais modificações em sua estrutura molecular podem ser feitas sem afetar suas capacidades de ligação.

Alguns dos primeiros exemplos bem sucedidos dessa abordagem, em que a estrutura guia o desenho racional das drogas, incluem o Captopril (Capoten) para o tratamento da hipertensão inibindo enzimas conversantes de angiotensina; Dorzolamida (Trusopt) para o tratamento do glaucoma pela inibição de anidrase carbônica; também muitas das drogas que fazem parte de coquetéis anti-AIDS que inibem a protease do HIV; e drogas Zanamivir (Relenza) e Oseltamivir (Tamiflu) para tratar influenza tipo A e influenza tipo B, também muito utilizado como tratamento durante a pandemia de gripe suína (H1N1) em 2009. Este último inibe uma proteína superficial do vírus da gripe, neuraminidase. No tratamento de alguns cânceres, doenças inflamatórias e diabetes, esse desenho racional tem sido amplamente utilizado nas chamadas quinases. Estas constituem uma classe de enzimas, que participam ativamente da regulação de processos celulares como metabolismo, crescimento e diferenciação. Vários inibidores de quinases desenvolvidos pelo design racional têm sido objeto de ensaios clínicos, sendo o Imatinib mais bem sucedido (Gleevec). Esta droga é usada para tratar leucemia mielóide crônica, tumores estromais gastrointestinais, e muitas outras malignidades. Vale ressaltar também que este foi o primeiro medicamento genérico para tratamento do câncer a ser produzido no Brasil.

Em relação ao tamanho do feixe, os feixes de micron e sub-micron são primordiais para combinar o feixe de raios X com mais precisão com o tamanho do cristal, em experimentos desafiadores (mas frequentemente encontrados) com pequenos cristais, e para sondar pequenas, mas mais uniformes, regiões de um cristal maior, porém menos uniforme. O tamanho dos cristais usados para a cristalografia de raios X é de particular importância porque a intensidade integrada de um pico de difração de raios X de um cristal é proporcional à razão de seu volume de difração ao volume celular unitário. Quanto maior e mais complicada a estrutura proteica se torna, mais desafiadoras são as tarefas necessárias para isolar a proteína intacta e cultivar cristais grandes e bem difundidos. Proteínas de membrana são notoriamente difíceis de cristalizar devido à sua natureza anfílica.

Quanto a amostras mais sensíveis aos danos causados pela radiação, os pequenos feixes permitem rasterar através do cristal para expor amostras frescas a raios X durante toda a coleta de um conjunto de dados. Além disso, há evidências de que uma grande fração dos danos causados pela radiação impingante é causada por fotoelétrons produzidos perto do feixe de raios X. Esses fotoelétrones são preferencialmente ejetados ao longo do vetor de polarização e são mais propensos a depositar sua energia perto do local exposto.  Mantendo o tamanho do feixe suficientemente pequeno, a porção exposta da amostra permanece menos danificada do que ao seu entorno.

EXPERIMENTOS DE CRISTALOGRAFIA EM SÉRIE (SSX) E EM TEMPERATURA AMBIENTE (RT)

A linha MANACÁ é dedicada aos experimentos convencionais de MX e também ao desenvolvimento de metodologias de cristalografia serial (SSX) e em temperatura ambiente (RT), a serem disponibilizadas para as comunidades de biologia estrutural local e mundial. A estratégia inclui a produção e o teste de um conjunto de dispositivos padrão baseados em microfluidica, pipelines de processamento de dados com um ambiente amigável e eficiente, desenvolvimento adicional de protocolos e ferramentas para tornar abordagens de entrega de alvo fixo e no fluxo confiáveis, como rotinas fáceis de usar na linha de feixe MANACÁ. O foco da equipe de linha e o trabalho contínuo são voltados para o desenvolvimento de dispositivos cristalográficos padrão e novos, metodologias para coleta rápida de dados, processamento e análise de RT e SSX, incluindo sistemas fixos de entrega de amostras e em jato (futuro). Os sistemas de alvo fixo são ferramentas poderosas na coleta de dados de cristalografia em série e RT. Eles serão dedicados à coleta de dados únicos e multi-cristal de cristais proteicos micro-para-nano-em tamanho em condições criogênicas e/ou de temperatura ambiente. Os sistemas de entrega de amostras em fluxo serão dedicados à elucidação da dinâmica estrutural proteica, detectando estados intermediários transitórios em interações proteína-ligantes. Sistemas microfluidos e baseados em injetores de alta viscosidade são os dois tipos de sistemas em fluxo que estarão disponíveis para os usuários. Atualmente, estamos trabalhando no comissionamento e desenvolvimento de dispositivos microfluidicos baseados em goniômetro/não-goniômetro dedicados a estudos de injeção de mídia de alta viscosidade e estudos de mix-and-injecting. Deve permitir que biólogos estruturais acessem técnicas cristalográficas seriais e coleta de dados de temperatura ambiente na estação microMANACÁ.

Os experimentos iniciais de SAD nativo foram realizados a 6,6 keV, onde um íon de sódio (Na), pode ser detectado entre os átomos da cadeia lateral da proteína em estudo. Estamos usando dispositivos criados nos laboratórios dos Professores Alke Meents e Richard Neutze e temos conduzido trocas frutíferas de ideias com seus grupos. Esta abordagem favorece o teste em larga escala de ligantes e a análise da plasticidade indutora de ligantes em estudos estruturais (rastreamento de proteínas-ligantes), mapeamento de intermediários enzimáticos e mudanças estruturais induzidas por fatores químicos (ou seja, ligantes, cofatores, etc.) e fatores físicos (ou seja, luz, pressão, etc.) em condições criogênicas e/ou de temperatura ambiente.

PUBLICAÇÕES

  • Noske, G.D.; Nakamura, A.M.; Gawriljuk, V.O.; Fernandes, R.S.; Lima, G.M.A.; Rosa, H.V.D.; Pereira, H.D.; Zeri, A.C.M.; Nascimento, A.F.Z.; Freire, M.C.L.C.; et al. A Crystallographic Snapshot of SARS-CoV-2 Main Protease Maturation Process. J. Mol. Biol. 2021, 433, 167118. doi: 10.1016/j.jmb.2021.167118.